红四氮唑作为电化学嵌合剂的核酸杂交生物传感器

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
CHI 660A型电化学工作站(上海辰华仪器厂，SYZ-A 型石英亚沸高纯水蒸馏器(江苏省金坛仪器厂，501型超级恒温装置(上海实验仪器厂，88-1型磁力搅拌器(上海司乐仪器厂，232 型饱和甘汞电极(3mol/L KCl)，铂丝对电极。两条含有23个碱基互补的单链DNA片段 5’-NH2-CCAAATGCAGGACAAATGCAACC-3’，ss-DNA(1)，和5’-GGTTGCATTTGTCCTGCATTTGG-3’，ss-DNA(2) (浙江大学生物研究所)，红四氮唑(上海前进试剂厂)，羟基丁二酰亚胺(NHS)及乙基-(3-二甲基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，AldriCh公司)，小牛胸腺DNA(上海化学试剂公司)，鱼精子 DNA(上海长阳制药厂)，0.2 mol/L NaH2PO4-Na2HPO4 磷酸盐缓冲液。水为二次蒸馏水，所有试剂均为分析纯。

1.2 实验方法
1.2.1 单链DNA片段在石墨电极上的固定
将自制浸蜡石墨电极作为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极(3mol/L KCl)铂丝为对电极，将三电极浸入到体积分数为2.5%的K2Cr2O7 和10%的HNO3溶液中，在恒电位(+1.5V)下氧化30s。将电极清洗后浸入含有1×10-3mol/L EDC 和1×10-2mol/L NHS的磷酸盐缓冲液(pH=6. 8)中，于60°C下加热活化10min。将 10μL 1×10-5mol/L ss-DNA(1)及pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液滴在电极表面后，自然晾干，洗净备用。

1.2.2 杂交过程
以1mL 0.2mol/L的磷酸盐缓冲溶液为底液，在杂交池中加入含有一定浓度的ssDNA(2)和NaCl溶液各10mL.。将上述固定好ssDNA(1)的电极插入杂交池中。在 60°C及+0.5V恒定电压下杂交50min。然后用体积分数为0.1%的十二烷基磺酸钠(SDS)和磷酸盐缓冲溶液冲洗电极15min，除去未杂交的单链DNA。

1.2.3 红四氮唑嵌合
将上述杂交好的石墨电极浸入一定浓度的红四氮唑的磷酸盐缓冲溶液中(pH=7.0)，均匀搅拌嵌合2min，嵌合完毕后用重蒸水清洗电极，除去附着在电极上的红四氮唑。

1.2.4 电化学测定
将嵌合好的DNA石墨电极作为工作电极，甘汞电极为参比电极，铂丝为对电极，以 0.2 mol/L pH 值为7.0 的磷酸盐缓冲溶液为底液进行伏安扫描。扫描电位在-0.3~-1.0V范围内，记录嵌入DNA分子双螺旋结构中的试剂所产生的还原电流，根据峰电流大小测定 DNA 含量。

参考文献
程琼, 彭图治. 红四氮唑作为电化学嵌合剂的核酸杂交生物传感器. 高等学校化学学报, 2002, 23, 1680-1683.