氯化硝基四氮唑蓝还原实验及注意事项

氯化硝基四氮唑蓝(NBT)是脱氢酶和其它过氧化酶的底物，以及凝血因子I的沉淀试剂。NBT也是碱性磷酸酶底物之一，在碱性磷酸酶的催化下可生成不溶性的蓝色产物。除此之外，NBT也常用于免疫组化（IHC）、免疫细胞化学（ICC）和蛋白印迹（WB）等实验。NBT还原实验是一种常用的用于检查机体细胞免疫功能的方法，本文将对其实验方法和注意事项进行总结。

NBT是水溶性淡黄色活性染料，当其被嗜中性粒细胞的酶还原，可接受氢离子变为非水溶性的蓝黑色甲臜颗粒，呈点状或片状沉淀在中性粒细胞胞浆内有酶活性的部位，因此可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分率。当机体受细菌、真菌和寄生虫感染时，嗜中性粒细胞的吞噬能力明显增强，还原NBT的能力亦随之增高，而病毒性感染或非感染性疾病则不增高。

具体实验方法如下：

在载玻片上滴加20~30μL肝素溶液；取受试者手指血约40~60μL，与载玻片上的肝素混匀；加入NBT溶液一滴，轻轻吹吸混匀；置于湿盒中，放入37°C恒温箱孵育15min后，转至室温再放置15min，并轻轻摇匀；将载玻片上的待检样本制成血涂片，自然晾干。

瑞氏-吉姆萨染液染色：将载片平放在玻璃板上，将染料滴加到载玻片上，让其均匀覆盖住载片上的血细胞，染色时间约为2~3min。等瑞氏染液有变红的趋势时，迅速滴加等量的PBS溶液，继续染色2~3分钟。染色时间到后，用PBS溶液冲片。冲片结束后将载片放到阴凉处风干。在玻璃板上放好牙签，将风干的载片倒扣在一根牙签上，从背面滴加基姆萨染液进行扣染，染色时间约为10分钟。时间到后用蒸馏水冲片，洗净染液后常温下风干。

镜检：凡中性粒细胞胞浆中含有蓝色甲臜颗粒者为NBT阳性细胞，计数100个中性粒细胞，计算NBT阳性中性粒细胞的百分率。正常人外周血中性粒细胞阳性率约为10%。百分率愈高，表明中性粒细胞的吞噬功能越强。阳性细胞百分率可作为区别细菌性与病毒性感染的指标之一，当机体受细菌感染时，NBT阳性细胞增多，受病毒感染时，NBT反应一般正常。

注意事项：

1、血液涂片应厚薄均匀，以免影响染色结果：太厚时红细胞容易重叠并易皱，太薄时又不容易找到白细胞；
2、血溶液要干透后才能染色，否则染色时血膜容易脱落；
3、瑞氏-吉姆萨染液不能过少，以防染液蒸发引起染液沉淀；
4、如果染色过淡，可复染，但最好不复染；染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用75%的乙醇脱色3~5s再镜检。如果染色过深或过浅，应调整染色时间或工作液的浓度；
5、染色液可重复使用，但不能多次重复，若有沉淀物应过滤后使用。

NBT还原实验可判断机体是否有感染性疾病，以及感染是否为病毒感染。NBT实验是诊断全身性感染的一种辅助方法，并作为判定嗜中性粒细胞杀菌功能的指标，以诊断吞噬功能缺陷症。但是在实验中要留心以上注意事项，方能得到准确的检测结果。同时为了安全和健康，要做好防护措施，穿实验服并戴一次性手套。