L-苯丙氨酸的制备方法很多， 有蛋白质水解提取法， 直接发酵法， 化学合成等。 化学合成法有苯甲醛法和苯乙醛法。

苯甲醛法
以苯甲醛和乙酰甘氨酸作用生成乙酰氨基桂皮酸， 然后催化加氢还原， 得乙酰-DL-苯丙氨酸(Ac-DL-phe), 最后经氨基酰化酶水解， 可拆分生成L-苯丙氨酸。

利用氨基酰化酶的专一性， 只水解Ac-L-phe的酰氨键， 生成L-phe, 而不能水解Ac-D-phe的酰胺。 然后根据L-phe和Ac-D-phe在水中的溶解度不同进行分离。而分离出的Ac-D-phe又可经消旋化生成Ac-DL-phe。 再一次重复水解、分离。 依次类推， 可将Ac-DL-phe全部转化为L-phe。

固定化氨基酰化酶的制备 将DEAE-sephadexa-50放入去离子水中充分浸泡后， 再依次用10倍量的0.5mol/L HCl和0.5mol/L NaOH溶液充分搅拌处理30min。 然后用去离子水洗至中性， 最后分别用0.1mol/L及0.01mol/L的pH=7.0的磷酸缓冲液处理1-2h, 滤干， 备用。

取经培养40-50h 的米麯扩大麯， 用其6倍量的支离子水分2次提取， 提取液用2mol/L的NaOH溶液调pH至6.7-7.0。 然后按100L酶液和1kg湿DEAE-sephadex A-50的比例混合， 于0-4℃搅拌吸附4-5h后， 过滤取DEAE-sephadexA-50, 并分别用去离子水0.1mol/L NaAc溶液、0.01mol/L 的pH=7.0的磷酸缓冲液洗涤3-4次。 过滤得固定化氨基酰化酶， 加1%甲苯放入冷库中贮存备用。

酶水解 在1000L水解罐中， 加入700L 0.1mol/L Ac-DL-phe钠盐溶液， 再逐步加入6mol/L的HCl调溶液pH至6.7-7.0， 再加入15-20kg固定化氨基酰化酶， 维持50℃约4h进行酶选择性水解反应后， 过滤取滤液， 得酶水解液(含L-phe和Ac-D-phe混合液)。

分离 将酶水解液用6mol/L的HCl调pH至4.8-5.1, 减压浓缩至35L左右， 并将其放置于0℃结晶过夜， 过滤取结晶， 用10L冷乙醇洗涤， 于80℃烘干3-4h, 得L-phe粗品， 滤液和洗涤液合并， 减压浓缩至20L左右， 得Ac-D-phe溶液， 待外消旋化后再重复进行酶水解、分离。
Ac-D-phe的外消旋化 将Ac-D-phe溶液60L， 加入100L反应罐中， 加入醋酐18.5L, 在25-45℃， 搅拌30min, 冷却放置6h。 再用浓HCl调pH值至1.5-2.0, 5℃结晶过夜， 过滤取结晶， 水洗， 滤干40℃真空干燥， 得Ac-DL-phe。

精制 在100L反应罐中， 加入5kg L-phe粗品， 加50L去离子水， 加热至100℃， 搅拌使其全溶， 再加入药用活性炭0.25kg, 搅拌脱色半小时后，趁热过滤， 滤液移入200L结晶罐中， 冷却至40℃， 加入50L， 40℃的95%乙醇，用6mol/L的HCl调pH至5.48， 于0℃结晶过夜， 过滤取结晶，用95%乙醇洗涤， 抽干， 80℃干燥3-4h, 得L-phe成品。母液再回收。

苯乙醛法
适用Bucherer反应， 生成苯甲基乙内酰脲， 然后碱性解得DL-苯丙氨酸(DL-phe)。

将DL-phe与醋酐作用生成Ac-DL-phe后， 按上述方法进行拆分， 可得L-phe。