用HPLC法测定大鼠血浆和胆汁中芹菜素的浓度
芹菜素(apigenin)是一种广泛分布于多种食用植物及中草药中的黄酮类化合物n]。药理研究表明，芹菜素具有抗肿瘤、抗炎、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成及抗焦虑等作用 j。目前，对芹菜素的作用机制及体内药动学的研究日益受到重视。有文献报道，动物口服主要成分是木犀草素和芹菜素的菊花提取物后，HPI C法检测不到血浆中的芹菜素∞j。有研究建立了SPE一柱切换HPLC法分析人尿液中的芹菜素浓度¨4j，但实验条件要求较高。本研究的目的是建立HPI C法测定静脉给药后大鼠血浆和胆汁中的芹菜素浓度，用于芹菜素的药动学研究。
l 材料
1.1 仪器和试剂 1100型HPLC仪(美国Agilent 公司)。芹菜素原料药(纯度为98%；芹菜素对照品；戊巴比妥钠(上海交通大学医学院附属新华医院动物房提供)；甲醇(色谱纯)、磷酸和乙酸乙酯(HPI C级，美国Tedia公司)；异丙醇(分析纯，常熟市杨园化工有限公司)；水为本院自制双蒸水。 1.2 动物SD雄性大鼠，体重220～270 gE上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物许可证号：SCXK (沪)2003—0003~。
2 方法和结果
2.1 溶液的配制 (1)标准溶液的配制精密称取 芹菜素对照品2O mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容配制成浓度为200 t,g/mL的储备液。储备液依次用甲醇稀释成8O、4O、20、10、5、4、2.5、1、 0.4 g/mL系列浓度，一4℃冷藏备用。(2)外标样品溶液的配制取空白大鼠血浆或胆汁，分别加入标准溶液，配制浓度分别为0.04、0.1、0.4、1、4、 8~g/mI 的血浆外标样品溶液和0.25、0.5、1、2、4、 8~g/mL的胆汁外标样品溶液，一4℃冷藏备用。 2.2 色谱条件Dikma Cl8色谱柱(250 mm× 4.6 mm，3.5 fm)，流动相为甲醇：0.2 (V/V)磷酸水溶液：66.5：33.5，检测波长350 nm，流速为 0.8 mL/min，柱温35℃，进样量l0 I 。
2.3 样品处理 取含药肝素抗凝血浆样品或胆汁样品0.2 mI，加5 mol/I 磷酸40 I，振摇后加提取溶液(乙酸乙酯：异丙醇一19：1)0.6 mI，充分振摇，于1.3×10 r/min(离心半径5.8 cm)离心 5 min。血浆样品取有机层0.45 mL，胆汁样品取有机层0.5 mL，50。C水浴氮气吹干，残余物用100 fI流动相溶解，取10肚L进样分析。
2.4 方法学考察
2.4.1 方法专属性 分别取6只大鼠的空白血浆和空白胆汁，按2.3项下方法操作；将一定浓度的芹菜素标准溶液加入空白血浆和胆汁中，同法操作；大鼠静脉注射20 mg/kg芹菜素对照品后1 h取血浆样品，同法操作；大鼠静脉注射芹菜素对照品 20 mg/kg后2～4 h取胆汁样品，同法操作，得到各自的色谱图见图1。结果表明，血浆中的内源性物质不干扰芹菜素的测定。
2.4.2 标准曲线的制备 取各个浓度的外标样品溶液，按2.3项下方法处理后进样测定。以芹菜素 对照品的峰面积(A)对相应的浓度(c)进行线性回归。结果显示，血浆样品在0.04～8>g/mI 范围内线性良好，其回归方程为：A一56.98 f+1.41，r－0.9998。胆汁样品在0.25～8~g/mI 范围内线性良好，其回归方程为：A一81.97 c一3.3l，r一 0.999 8。
2.4.3 精密度和准确度实验 取空白血浆和空白胆汁，配制低、中、高浓度分别为0.04、l、8 g/mL 的血浆质控样品和浓度为0.25、2、8#g/mL的胆汁质控样品，连续测定5 d，将质控样品测得浓度与配制浓度相对照，求得准确度与精密度，见表1。
2.4.4 稳定性实验 取空白血浆和空白胆汁配制低、中、高浓度分别为0.04、1、8 g/mL的质控样品，分别考察样品冷冻一解融1次和2次；室温下放置4 h以及冷冻l周的稳定性。每一浓度进行3样本分析。结果表明，质控样品在各条件下均稳定。
2.5 药动学研究
2.5.1 血浆样本采集 SD大鼠5只，尾静脉注射给予20 mg/kg芹菜素对照品，于给药即刻及给药后2.5、5、10、20、30、60、90、120、180和240 min眼眶取血，血液用适量肝素抗凝，3 000 r/min(离心半径5.8 cm)离心10 min，血浆转移至1.5 mL聚丙烯管，置于～20℃冰箱保存，待测。
2.5.2 胆汁样品采集 SD大鼠5只，用3 戊巴比妥钠麻醉，仰卧固定，腹部切口，胆道插管完成后，尾静脉注射20 mg/kg的芹菜素对照品，分别收集给药后0～2、2～4、4～12、12～24 h的胆汁。收集样本所用的聚丙烯管中先加入5 mol/I 磷酸 200 L作为稳定剂。精密测定各时间段收集的胆汁体积，并置于一20℃冰箱保存，待测。
2.5.3 药动学参数 根据所测得的血药浓度做血药浓度一时间曲线。结果显示，静脉给药后血药浓度迅速下降，表明药物消除迅速。利用DAS药动学参数计算程序拟合处理，得到静注芹菜素的血药浓度时间曲线符合二室模型的特征，主要药动学参数见表2。
2.5.4 胆汁排泄实验 胆汁排泄的峰值为给药后 O～2 h内，24 h的总排泄量约为给药量的5.64%。
3 讨 论
本实验建立了测定大鼠血浆和胆汁中芹菜素浓度的方法，并对芹菜素的药动学进行了初步研究。大鼠尾静脉给予芹菜素后体内消除较快，胆汁排泄迅速，由色谱图可明显看到可能的代谢产物色谱峰，推测为葡萄糖醛苷结合物。有研究报道，给狗灌服主要成分是木犀草素和芹菜素(含量分别为7.60 和5.19 )的菊花提取物后，血浆中不能检测到芹菜素的含量[3]。研究者分析可能由于经胃肠道给药后，芹菜素转化为木犀草素，也有可能是芹菜素快速通过胆汁排泄。因此，本研究给大鼠注射芹菜素后，考察了芹菜素在大鼠血浆和胆汁中的浓度。有体外实验研究表明，芹菜素的代谢产物有木犀草素、野黄芩苷及异野黄芩苷 。作者所在的课题组正在对胆汁样品中可能的芹菜素代谢产物进行结构研究。
芹菜素静脉注射后，血药浓度范围较大，为了使分析样品的浓度在线性范围内，有必要对高浓度的样品进行稀释，所以本研究考察了血浆和胆汁样品分别稀释至原浓度的1/10和1/20后的准确度和精密度，结果表明稀释不影响高浓度样品的分析测定。