噻唑蓝染色法：让细胞生长看的见

摘要：噻唑蓝比色法由于具有简便、快速、经济、不使用同位素等优点,现已在基础医学、临床医学和生物学研究等许多领域得到广泛应用。本文对该方法的原理、基本方法,应用及其方法的改进作一综述。

关键词：MTT，噻唑蓝，细胞生长。

前言

随着病原微生物学、药理学和肿瘤学研究的不断深入和发展，科研部门和临床医院对抗肿瘤药物、微生物病原体及活菌计数、细胞毒性的研究检测工作日益增多，以往采用的检测方法如同位素法、台盼蓝法以及 ELISA 法等，虽能测定出相应实验结果，但检测过程中多因操作过程繁琐、检测周期长、需特定仪器设备、易污染环境等而不尽人意［1］。长期以来，人们一直致力于探索新的更快速、更准确的检测方法来满足科研部门和医院测定工作的需要。MTT 比色法是20世纪 80 年代发展起来的一种检测细胞数量和增殖状况的方法，自Mosmann于1983年首创 MTT 比色法用于检测IL－2的生物学活性以来，MTT法凭借操作简便、重复性好等优点而受到人们的普遍青睐，现已广泛应用于各个领域。

1 MTT比色法的原理、方法及特点

1.1基本原理

MTT,即溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-dipenyl terazolium bromide〕,cas 298-93-1简称四唑盐,又名噻唑蓝;MTT产品为淡黄色粉末,易被水溶解和透过细胞膜而进入细胞内。可被活细胞内的琥珀酸脱氢酶还原,形成不溶于水的蓝紫色Fortnazam结晶。该结晶可溶于酸性异丙醇、二甲亚砜、SDS等有机溶剂中,通过多孔扫描分光光度计依颜色深浅可测定出各吸光度值。由于结晶物形成的量与细胞数量及代谢活性成比例,因此吸光度(A)值的大小可反映细胞的数量及活性。

1.2基本操作过程

1.2.1制备靶细胞,将细胞接种于细胞培养板中,根据靶细胞不同选择每孔1口一1护个不同的细胞数,预培养(或无)。

1.2.2加入待测的细胞因子或化学药物等,同时设相应的对照,置37℃5%CO2环境中培养,培养时间随测定内容及靶细胞不同而异。

1.2.3培养终止前4h加入5mg/ml的MTT溶液10～25μl/孔。

1.2.4终止培养,将所形成的结晶物用有机溶剂完全溶解后,在分光光度计上测定其在波长490nm或570nm处的A值(不同溶剂使用测定波长不同)。用回归法或概率法推算出活性因子的单位、药物敏感性或效应细胞杀伤率等。

1.3 MTT比色法的特点

1.3.1特异性强。因为琥珀酸脱氢酶只存在于活细胞线粒体内,而不存在于上清液中,所以死细胞和红细胞均不影响测定结果［2］。

1.3.2灵敏度高。本法在检测巨噬细胞毒活性闭［3］、LAK细胞毒活性［4］等时灵敏度均高于同位素法;在检测抗癌药物敏感性方面比台盼蓝法准确、灵敏、特异［5］。

1.3.3快速、准确、重复性好。培养和比色过程中不需洗涤细胞,省时并可避免细胞的丢失,而且比色测定可半自动化,受人的主观因素影响较小,从而减少了样品误差,可同时对大样本,多种因素进行检测。

1.3.4操作简便、节省材料、不铸特定仪器,无同位素污染,便于实验室开展应用。

2 MTT比色法的应用

2.1 植物抗细胞增殖物质成分筛选研究中的应用

2.1.1 中草药提取物体外抗肿瘤活性

据《本草纲目》等记载，蛇六谷(魔芋)具有性寒、味平、化痰散积及行淤消肿之功，用于治疗咳嗽、疟疾、臃肿风毒等 . 因有解毒抗癌之效而被现代用于治疗各种恶性肿瘤 。采用 MTT 比色法观察蛇六谷各提取物对人肝癌 HepG－2 细胞及大鼠胶质瘤C6细胞增殖抑制作用进行药物筛选，结果表明:蛇六谷醋酸已酯萃取物、石油醚萃取物对HepG－2细胞及C6细胞呈明显的量效增殖抑制作用［6］; 林董［7］等也采用MTT比色法，对芸香、低榆、甘草、柴胡、莪术、蜜蒙花、半边莲和旱芹等8种中草药体外抗肺癌细胞SPC－A1的活性进行检测。结果表明，浓度为1.5mg/mL的莪术乙醇浸提液(ESCC)和甘草乙醇浸提液(ESCG)对体外培养的肺癌细胞SPC－A1呈较强的浓度依赖性抑制增殖作用。综上实验都是通过MTT法来反应细胞增殖状态从而间接对中草药体外抗肿瘤作用及机制的研究进行了初步探讨，为其临床治疗肿瘤提供了理论依据，且奠定了从天然中草药中开发抗肿瘤新药基础，但其作用机制仍不太明确而有待进一步研究 。

2.1.2 胡桃楸提取物抑制弓形虫增殖

文秋嘉［8］等收集感染弓形虫小鼠腹水并稀释至含虫1×107个/mL，采用MTT比色法测定胡桃楸提取物(JMME)及其含药血清对虫体增殖情况的影响，同时设置乙酰螺旋霉素为对照组，结果显示:胡桃楸提取物可明显抑制弓形虫增殖，且具有剂量依赖性，浓度大于30μg/mL 的抑虫效果优于乙酰螺旋霉素组(P＜0.05).弓形虫可通过胎盘屏障垂直传播至胎儿，孕妇感染可引起胎儿畸形( 无脑儿、脊柱裂)以及新生儿的先天性弓形虫病(智力低下、癫痫、致盲及死亡)，严重影响优生优育 。研究表明: 胡桃楸提取物对弓形虫具有明显的增殖抑制和破坏作用，为研究体外抗弓形虫药物奠定了理论依据 。该实验通过应用 MTT 比色法来观察虫体细胞在药物作用下的增殖状态，间接评价了药物抗弓形虫的作用效果，继而避免了传统弓形虫计数采用的普通染色计数法所带来的工作量大、误差大的问题，适合抗虫药物的初步筛选［9］。

2.1.3 乌骨藤对慢性髓性白血病细胞增殖抑制作用

乌骨藤始载于《滇南本草》，性味苦，微寒，具清热解毒、消炎镇痛与止咳平喘等功效，可治疗肺炎、慢性支气管炎、咳喘等疾病。现代药理研究表明，乌骨藤含有多种甾体酯苷、生物碱、有机酸、多糖、树脂及色素等多种化学成分，其独特化学成分具有明显的抗肿瘤活性［10］。曾琛［10］等通过 MTT比色法探讨乌骨藤提取物是否对人慢性髓性白血病K562细胞存在抑制作用，结果表明: 乌骨藤对 K562 增殖有明显的抑制作用，同时亦可以明显抑制人肺、胃、肝、大肠来源的癌细胞，且毒副作用轻微。但目前乌骨藤的抗肿瘤作用机制仍未完全阐明，其质量控制指标也有待商榷。

2.2 癌细胞电离辐射敏感性研究中的应用

2.2.1 c－erbB－2－siRNA 对结肠癌细胞的放射增敏作用

赵东利［11］等采用X射线单纯放射和放射联合应用siRNA质粒方法探讨两者对结肠癌细胞 HT－2放射增敏效果 。通过 MTT 比色法测定不同剂量X射线在实验组(A组)与转染试剂对照组(B组)、阴性质粒对照组(C组)细胞吸光度(A值)，继而计算比较各组细胞存活分数( SF)。实验数据显示，A组在吸光度 A 值、SF 实验数据均明显低于B、C两组;同时，从不同剂量 X 射线细胞周期分布数据表明，在相同SF下，A组所需X射线剂量最低。综上说明，对结肠癌细胞HT－29进行放射合并c－erbB－2－siRNA可起到放射增敏作用，能在较低剂量射线作用下降低细胞生存率。本实验通过凋亡调节改变肿瘤放射敏感性，对临床在较小的毒副反应下治疗肿瘤提供一个新的思路。

2.2.2 肝癌细胞γH2AX表达与X射线剂量呈正相关

周萍［12］等采用MTT比色法检测不同剂量X射线照射肝癌细胞系HepG2后其吸光度A值及相应死亡率，从而探讨肝癌细胞γH2AX表达水平与电离辐射敏感性关系。数据显示，1GyX射线照射时，HepG2死亡率为10.7%，以8GyX射线照射时，HepG2死亡率为47.4%。照射剂量在1～8Gy范围内增大，HepG2死亡率亦逐渐增高，HepG2死亡率与X射线剂量呈正相关;同时，HepG2死亡率与表达γH2AX的细胞分数高度相关r2=0.951，P＜0.05，HepG2灶点数与其死亡率高度相关，r2= 0.984，P＜0.05。综上可知，X射线剂量与HepG2γH2AX表达呈正相关。

2.2.3 重离子诱导人舌鳞癌细胞凋亡

重离子因具有高传能线密度，在肿瘤治疗中比传统的放射治疗具有显著优势［13］. 有学者给予人舌鳞癌Tb细胞重离子束12C6+辐射，探讨重离子对细胞凋亡及 Bax/Bcl－2蛋白表达影响，采用MTT比色法检测细胞存活率。据MTT比色法绘制的剂量－效应曲线显示，Tb细胞经12C6+辐射后，存活率显著下降，呈剂量依赖性增殖抑制，其中12C6+辐射24h、48h后细胞存活率下降最为明显［14］。综上说明，对Tb细胞给予24h以上的12C6+辐射，其DNA损伤程度高于自身基因修复能力，继而凋亡相关基因被激活并诱导细胞凋亡，这意味着Tb细胞受重离子辐射后摆脱了对放射线抗拒期(G0/G1期)，而进入对放射线敏感期(G2/M期)，这也是临床分割放疗和超分割放疗的理论基础之一，本实验为该理论提供了现实依据。

结束语

MTT法在很多领域都有应用，在此就不一一叙述了，但是人们还是比较关心其在癌症方面的应用，希望通过它能够找到治疗癌症的药物，让癌症不再让人觉得恐惧，让我们人类的寿命能够更长一点，能做更多的事。