高效液相色谱法测定硫代水杨酸

摘 要：应用乙腈/0.5%高氯酸的体积比率为35:65为流动相，在Kromasil色谱柱上，以苯甲酸为内标，建立了以邻氨基苯甲酸为原料合成硫代水杨酸的高效液相色谱分析方法.硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸的相对标准偏差分别为0.19%，0.97%，硫代水杨酸的进样量在0.1～5.0μg内呈良好的线性关系(r=1.000)， 邻氨基苯甲酸的进样量在0.3～15.0μg内呈良好的线性关系(r=0.9999).

关键词: 高效液相色谱　硫代水杨酸　邻氨基苯甲酸　苯甲酸

硫代水杨酸是白色或浅黄色针状结晶或结晶性粉末，主要用作生化试剂，也可作为精细化工中间体和特殊染料的原料.目前，国内外有关硫代水杨酸含量测定的仪器分析方法较少，有文献报导采用甲醇/水体系进行液相色谱分析，本文选用乙腈/0.5%高氯酸的体积比率为35:65为流动相，在Kromasil色谱柱上，以苯甲酸为内标，建立了以邻氨基苯甲酸为原料合成的硫代水杨酸的高效液相色谱分析方法，能同时对硫代水杨酸和杂质邻氨基苯甲酸进行测定，分离效果好，操作简单，分析速度快，定量准确， 硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸的相对标准偏差分别为0.19%，0.97%，符合定量分析要求.

1 实验部分
1.1 仪器
日本岛津ＬＣ－９Ａ型高效液相色谱仪;
Spd-6AV紫外可见分光光度检测器;
C-R6A色谱数据处理机;
DGU-4A型超声波脱气机;
20μL定量进样器.

1.2 试剂
硫代水杨酸标准样品：含量≥99.99%；
邻氨基苯甲酸标准样品:含量≥99.99%;
苯甲酸: 分析纯; 
高氯酸：分析纯；
内标溶液: 称取苯甲酸约5g于100mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀.
标准溶液: 称取硫代水杨酸标准样品约0.1g(精确到0.0002g)和邻氨基苯甲酸约0.3g (精确到0.0002g)于100mL容量瓶中，加入50mL甲醇，在超声波清洗机中振荡，使之完全溶解，准确移入10.00mL内标溶液，用甲醇定容，摇匀.
乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，水为二次蒸馏水， 流动相在使用前需经0.45μm滤膜过滤.

1.3 高效液相色谱分析条件
    色谱柱：Kromasil C18（150mm×4.6mmi.d.）;
流动相: 乙腈/0.5%高氯酸的体积比率为35:65，流速1.0mL/min;
紫外检测波长:254nm;
柱温:40℃.

1.4 试验方法
称取样品约0.1g (精确到0.0002g)于100mL容量瓶中，加入50mL甲醇，在超声波清洗机中振荡，使之完全溶解，准确移入10.00mL内标溶液，用甲醇定容，摇匀.
待仪器稳定后，采用内标法进行色谱分析，分析结果由色谱数据处理机自动处理.

2 结果与讨论
2.1 样品溶剂的选择
    硫代水杨酸产品不溶于水和乙腈，能溶于甲醇，N，N-二甲基甲酰胺，氢氧化钠水溶液.试验表明: 甲醇作溶剂能完全溶解样品，且分析纯甲醇在本方法检测波长下无紫外吸收，不含干扰测定的杂质，因此选择甲醇作为样品溶剂.

2.2 流动相的选择
由于硫代水杨酸存在解离作用，在色谱柱上保留值小，与杂质的分离效果不好，所以加入高氯酸抑制硫代水杨酸的解离，增加其在色谱柱的保留值，改善分离情况.改变乙腈-水-高氯酸配比，考察样品中硫代水杨酸与邻氨基苯甲酸等杂质的分离情况.试验表明: 乙腈-水-高氯酸体系中当乙腈/0.5%高氯酸的体积比率为35:65时，样品峰与杂质峰已完全分离，且分析速度快. 因此选择体积比率为35:65的乙腈/0.5%高氯酸为流动相.

2.3 内标物的选择
为了选择合适的内标物，试用了邻苯二甲酸，苯甲酸，邻氯苯甲酸等化合物.试验表明: 苯甲酸的保留值与硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸的保留值较接近，分离情况见图一，且分析纯苯甲酸不含干扰测定的杂质，因此选择苯甲酸作为样品的内标物.


图一 样品与内标物分离色谱图
1-硫代水杨酸  3-邻氨基苯甲酸  2-苯甲酸

2.4 检测波长的选择
    以甲醇为参比，将硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸，苯甲酸于紫外可见光谱仪上在400～190nm范围内分别进行扫描.结果表明: 硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸，苯甲酸均有较强的紫外吸收，为保证样品的灵敏度和减少杂质的背景吸收不干扰测定，因此选择检测波长为硫代水杨酸的次灵敏吸收波长254nm，此波长下分析纯苯甲酸不含干扰测定的杂质，，且硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸，苯甲酸均有较好的灵敏度.

2.5 线性关系
以甲醇为溶剂，配置硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸，苯甲酸的标准系列， 硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸，苯甲酸的浓度分别为:0.1，0.5，1，3，5mg/mL; 0.3，1.5，3，9，15mg/mL; 0.5，2.5，5，15，25mg/mL，各进样1μL，记录对应峰面积.将峰面积(y)与进样量(x)之间进行线性回归法处理，分别得到以下回归方程:
硫代水杨酸:    y=16169x+69(r=1.000)
邻氨基苯甲酸:  y=5741x+42(r=0.9999)
苯甲酸:        y=3726x-36(r=0.9998)
   
 结果表明: 硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸，苯甲酸的进样量在0.1～5.0μg， 0.3～15.0μg ，0.5～25.0μg范围内呈良好的线性关系.
2.6 加入回收试验
将硫代水杨酸，邻氨基苯甲酸标准品加入到试样中，测定回收率，结果见表一.回收率符合符合定量分析要求.
表 一
试样号      加入，mg                    回收，mg            回收率，%
  硫代水杨酸 邻氨基苯甲酸 硫代水杨酸 邻氨基苯甲酸 硫代水杨酸 邻氨基苯甲酸
1  　0.1086     0.0501 　　 0.1083 　 0.0496           99.72          98.95
2 　 0.2013     0.1026 　　 0.1998      0.1040           99.26  　　 101.34
3  　0.3049     0.1471 　　 0.3055      0.1479          100.21        100.56
4  　0.4026     0.2156  　　0.4001  　 0.2140     　  99.38       　99.27
5      0.5011    0.2478        0.4984      0.2499           99.46        100.85

2.7 精密度试验
应用本测定方法对硫代水杨酸产品进行多次分析，结果见表二，测定的精密度符合定量分析要求.
表 二
                  测定结果，%             平均值，%      
     硫代水杨酸  邻氨基苯甲酸 硫代水杨酸  邻氨基苯甲酸
       93.62           0.820
       93.78           0.818
       93.56           0.798
       93.38           0.809           93.56          0.811
       93.45           0.816
       93.86           0.801
       93.44           0.809
       93.38           0.814
                            标准偏差，%                     相对标准偏差，%
        硫代水杨酸    邻氨基苯甲酸    硫代水杨酸 邻氨基苯甲酸
          0.18              0.0079             0.19            0.97

3 结论
    本方法对以邻氨基苯甲酸为原料合成的硫代水杨酸的高效液相色谱分析方法进行研究，对色谱条件和方法的稳定性、重现性等进行试验。通过加入回收试验，硫代水杨酸平均回收率达99.60％，且数据的稳定性和重现性较好，验证了本方法的可靠性。
    本方法操作方便、快速，并具有较高的灵敏度，可作为硫代水杨酸产品的测试方法。

4 参考文献
1 Procopio，Jesus.R;Hernandez，Cucas.J.Chromatogr.1993，653(2)，267-73(Eng).
2 Procopio，Jesus.R;Da silva，M.pilar;Carmen Talanta 1992，39(12)，1619-23(Eng)
3 张玉奎，张维冰，邹汉法.分析化学手册 第六分册.北京:化学工业出版社，2000.21